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蛋白發(fā)光染液：蛋白質(zhì)檢測(cè)的關(guān)鍵技術(shù)工具

更新時(shí)間：2025-06-20 點(diǎn)擊次數(shù)：483

在生命科學(xué)研究、生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)以及醫(yī)學(xué)診斷等眾多領(lǐng)域，蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確檢測(cè)與分析至關(guān)重要。蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的主要執(zhí)行者，其表達(dá)水平、修飾狀態(tài)以及相互作用等信息，為揭示生命過(guò)程的奧秘、疾病的發(fā)生機(jī)制以及開(kāi)發(fā)新型治療方法提供了關(guān)鍵線索。蛋白發(fā)光染液作為一種強(qiáng)大的蛋白質(zhì)檢測(cè)工具，通過(guò)與蛋白質(zhì)特異性結(jié)合并產(chǎn)生可檢測(cè)的發(fā)光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白質(zhì)的高靈敏度、高特異性檢測(cè)，在現(xiàn)代生物學(xué)研究中占據(jù)著地位。

一、工作原理

蛋白發(fā)光染液的工作原理基于多種化學(xué)反應(yīng)和物理現(xiàn)象，不同類(lèi)型的發(fā)光染液具有各自作用機(jī)制。目前，應(yīng)用較為廣泛的蛋白發(fā)光染液主要包括基于化學(xué)發(fā)光和熒光發(fā)光兩種類(lèi)型。

（一）化學(xué)發(fā)光染液

以常用于免疫印跡（Western Blot）實(shí)驗(yàn)的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）染液為例，其核心反應(yīng)體系涉及辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和魯米諾。在該體系中，當(dāng) HRP 標(biāo)記的抗體與膜上的目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合后，加入含有魯米諾和過(guò)氧化氫的 ECL 工作液。在 HRP 的催化作用下，過(guò)氧化氫分解產(chǎn)生氧自由基，氧自由基將魯米諾氧化為激發(fā)態(tài)的 3 -

氨基鄰二甲酸，當(dāng)激發(fā)態(tài)的 3 - 氨基鄰苯二甲酸回到基態(tài)時(shí)，會(huì)以光的形式釋放能量，從而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)。通過(guò)檢測(cè)這種發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)度和位置，即可確定目標(biāo)蛋白的存在和含量。一些 ECL 發(fā)光染液中還添加了特殊的增強(qiáng)劑，能夠顯著增強(qiáng)發(fā)光信號(hào)并延長(zhǎng)發(fā)光時(shí)間，使其檢測(cè)靈敏度可達(dá)到飛克（fg，10?1?g）級(jí)別，極大地提高了對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)能力。

（二）熒光發(fā)光染液

熒光蛋白發(fā)光染液則利用了熒光染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后在特定波長(zhǎng)光激發(fā)下發(fā)出熒光的特性。例如，DyLight 系列熒光染料，其具有良好的水溶性、pH 不敏感性、高亮度、光穩(wěn)定性以及較長(zhǎng)的圖像采集時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)。這些染料可以通過(guò)與蛋白質(zhì)的氨基或巰基等活性基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的標(biāo)記。在合適的激發(fā)光照射下，被標(biāo)記的蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)出特定波長(zhǎng)的熒光，通過(guò)熒光成像設(shè)備檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度和分布，從而對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。不同熒光染料具有不同的激發(fā)和發(fā)射光譜，科研人員可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的熒光染料，實(shí)現(xiàn)對(duì)多種蛋白質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)，即所謂的多重檢測(cè)技術(shù)。

二、類(lèi)型與特點(diǎn)

（一）ECL 超敏發(fā)光液

ECL 超敏發(fā)光液在免疫印跡實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用極為廣泛。如美侖生物的飛克特超敏 ECL 發(fā)光液，其對(duì)抗原的檢測(cè)限可達(dá)飛克級(jí)，具有靈敏度。在實(shí)驗(yàn)中，一抗（1 mg/mL）儲(chǔ)存液可稀釋 1:1,000 至 1:50,000 倍，二抗（1mg/mL）儲(chǔ)存液可稀釋 1:50,000 至 1:200,000 倍，大大節(jié)省了抗體的使用量。該發(fā)光液的發(fā)光信號(hào)持久，結(jié)果可通過(guò) X 光膠片曝光或其他熒光成像設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。此外，像 EnlightTM 這種超靈敏的 ECL 發(fā)光液，含有發(fā)光增強(qiáng)劑和穩(wěn)定劑，不僅靈敏度高，能檢測(cè)到微弱信號(hào)，而且在 4℃儲(chǔ)存 1 年以上，信號(hào)強(qiáng)度不變。同時(shí)，其含有的精準(zhǔn)發(fā)光底物可提高信噪比 110 倍以上，在靈敏度更高的同時(shí)背景卻更低，發(fā)光時(shí)間長(zhǎng)達(dá)幾小時(shí)以上，便于實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行曝光操作。

（二）熒光染料類(lèi)發(fā)光染液

DyLight 系列：DyLight 系列熒光染料涵蓋了從可見(jiàn)光到紅外光區(qū)域的多種產(chǎn)品，如 DyLight 488、DyLight 549、DyLight 649、DyLight 680 和 DyLight 800 等。這些染料的激發(fā)和發(fā)射光譜與常見(jiàn)的激光和濾光片組兼容，在免疫分析、蛋白質(zhì)印跡、微陣列、細(xì)胞染色、流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光等多種應(yīng)用中表現(xiàn)出色。例如，在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，DyLight 染料標(biāo)記的抗體能夠清晰地顯示細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)蛋白的定位和分布，為研究蛋白質(zhì)的功能和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑提供了有力工具。苯Pro - Q Diamond 熒光染料：該染料專門(mén)用于磷酸化蛋白質(zhì)的染色。其具有方便、快速、高靈敏度的特點(diǎn)，線性范圍超過(guò) 3 個(gè)數(shù)量級(jí)，并且與質(zhì)譜鑒定兼容。在 2003 年由 Molecular Probes 的 Wavne Patton 報(bào)道，其激發(fā)光波長(zhǎng)為 488 nm，吸收峰波長(zhǎng)為 532 nm。研究人員通過(guò)將一些蛋白質(zhì)和肽點(diǎn)樣在蛋白質(zhì)芯片上，使用 Pro - Q Diamond 檢測(cè)芯片上蛋白質(zhì)和肽的磷酸化水平，靈敏度可達(dá) 312 - 625 fg，為信號(hào)通路和磷酸酶抑制研究提供了良好的平臺(tái) 。

ProteOrange® 染料：用于聚丙烯酰胺凝膠電泳后蛋白質(zhì)的快速可視化。它是一種含有兩性離子片段的芪型熒光團(tuán)，在核酸、多糖和其他分子存在的情況下，蛋白質(zhì) / 十二烷基硫酸鈉膠束（SDS）會(huì)選擇性地結(jié)合該染料。分子量在 6 kDa 及以上的蛋白質(zhì)可被有效染色，熒光信號(hào)與蛋白質(zhì)濃度在三個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。ProteOrange 凝膠染色的靈敏度約為考馬斯亮藍(lán)染色的十倍，雖然低于銀染色，但與銀染色相比，其染色方案要簡(jiǎn)單得多，不需要洗滌，對(duì)于標(biāo)準(zhǔn) SDS - PAGE 也不需要固定步驟。整個(gè)染色過(guò)程 30 - 60 分鐘即可完成，包括將凝膠在含有染料的 7.5% 乙酸水溶液中孵育，然后用 7.5% 乙酸短暫沖洗 30 秒。使用波長(zhǎng)為 312 - 365 nm 的透射儀即可進(jìn)行可視化。

Lumitein™蛋白質(zhì)凝膠染色劑：設(shè)計(jì)用于檢測(cè) SDS 聚丙烯酰胺（SDS - PAGE）凝膠中的蛋白質(zhì)，經(jīng)過(guò)額外的 SDS 孵育步驟后，也可用于檢測(cè)天然 PAGE 凝膠中的蛋白質(zhì)。該染色劑具有靈敏度，可檢測(cè)到小于 1 ng 的蛋白質(zhì)，與銀染色靈敏度相當(dāng)。操作簡(jiǎn)單快速，固定和染色可在 30 - 90 分鐘內(nèi)一步完成，隨后只需用清水簡(jiǎn)單沖洗。背景極低，與常見(jiàn)儀器兼容，可使用 300 nm 紫外凝膠盒（EB 濾光片）、Dark Reader 或激光掃描儀進(jìn)行成像。線性檢測(cè)范圍寬，至少可達(dá)三個(gè)數(shù)量級(jí)，并且與下游分析（如質(zhì)譜和測(cè)序）兼容，在室溫下穩(wěn)定性高。

三、操作流程

（一）免疫印跡（Western Blot）中 ECL 發(fā)光染液的操作

樣品制備與電泳：首先，將待檢測(cè)的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行處理，如細(xì)胞裂解、組織勻漿等，以提取蛋白質(zhì)。然后通過(guò)十二烷基硫酸鈉 - 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS - PAGE）根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小對(duì)其進(jìn)行分離。

轉(zhuǎn)膜：將凝膠上分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜（如 PVDF 膜或硝酸纖維素膜）上，使蛋白質(zhì)固定在膜上，便于后續(xù)與抗體結(jié)合。

封閉：用含有封閉劑（如 5% 脫脂奶粉或 BSA）的緩沖液孵育膜，封閉膜上非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景信號(hào)。

一抗孵育：將膜與特異性識(shí)別目標(biāo)蛋白的一抗孵育，一抗與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合。孵育條件通常為 4℃過(guò)夜或室溫孵育 1 - 2 小時(shí)，具體時(shí)間根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)確定。

二抗孵育：用洗滌緩沖液（如 PBST）充分洗滌膜后，加入與一抗來(lái)源物種匹配的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗。二抗與一抗結(jié)合，從而將 HRP 標(biāo)記到目標(biāo)蛋白所在位置。二抗孵育一般在室溫下進(jìn)行 1 - 2 小時(shí)。

洗膜：再次用洗滌緩沖液充分洗滌膜，去除未結(jié)合的二抗，以降低背景信號(hào)。

發(fā)光液混合與孵育：新鮮配制 ECL 工作液，將 A 液和 B 液按照 1:1 的比例混合均勻。將混合后的發(fā)光液均勻覆蓋在膜表面，確保膜浸潤(rùn)在發(fā)光液中，室溫孵育 1 - 5 分鐘，使發(fā)光反應(yīng)充分進(jìn)行。

信號(hào)檢測(cè)：孵育完成后，用鑷子小心取出膜，去除多余的發(fā)光液（可將膜輕靠在吸水紙上吸干多余液體，但避免膜干燥）。若使用 X 射線膠片檢測(cè)，將膜放入雜交袋中，排出空氣后密封，在暗室中將膠片覆蓋在膜上曝光適當(dāng)時(shí)間（根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度調(diào)整曝光時(shí)間，從幾秒到數(shù)小時(shí)不等），然后進(jìn)行膠片顯影和定影處理；若使用化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)，將膜放入成像儀樣品室中，設(shè)置合適的曝光時(shí)間和增益參數(shù)，進(jìn)行圖像采集和分析。

（二）熒光染料標(biāo)記蛋白質(zhì)的操作流程

染料選擇與準(zhǔn)備：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮偷鞍踪|(zhì)特性選擇合適的熒光染料，并按照說(shuō)明書(shū)要求將染料溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲校渲瞥伤铦舛鹊墓ぷ饕骸?/span>

蛋白質(zhì)標(biāo)記：將待標(biāo)記的蛋白質(zhì)與熒光染料工作液按照一定比例混合，在適當(dāng)條件下孵育，使染料與蛋白質(zhì)充分結(jié)合。反應(yīng)條件（如溫度、時(shí)間、pH 值等）需根據(jù)染料類(lèi)型和蛋白質(zhì)性質(zhì)進(jìn)行優(yōu)化。例如，對(duì)于一些與氨基反應(yīng)的熒光染料，通常在中性或弱堿性條件下進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)，孵育時(shí)間一般為 1 - 2 小時(shí)。

標(biāo)記后處理：標(biāo)記反應(yīng)完成后，通過(guò)透析、超濾或凝膠過(guò)濾等方法去除未結(jié)合的游離染料，以獲得純凈的標(biāo)記蛋白質(zhì)樣品。

檢測(cè)與分析：將標(biāo)記好的蛋白質(zhì)樣品用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如免疫熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)分析等。在檢測(cè)過(guò)程中，使用相應(yīng)的熒光激發(fā)光源和檢測(cè)設(shè)備，根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)度、分布等參數(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。例如，在免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)中，將標(biāo)記蛋白質(zhì)的樣品與細(xì)胞或組織切片孵育，然后在熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào)，確定蛋白質(zhì)在細(xì)胞或組織中的定位和表達(dá)水平。

四、應(yīng)用場(chǎng)景

（一）生命科學(xué)研究

蛋白質(zhì)表達(dá)與功能研究：在探究基因功能時(shí)，需要了解基因表達(dá)產(chǎn)物 —— 蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和功能。通過(guò)使用蛋白發(fā)光染液，科研人員可以準(zhǔn)確檢測(cè)蛋白質(zhì)在不同細(xì)胞系、組織或發(fā)育階段的表達(dá)變化。例如，在研究腫瘤發(fā)生機(jī)制時(shí)，利用 ECL 超敏發(fā)光液結(jié)合 Western Blot 技術(shù)，檢測(cè)腫瘤相關(guān)蛋白在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)差異，有助于發(fā)現(xiàn)潛在的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。在蛋白質(zhì)功能研究方面，通過(guò)熒光染料標(biāo)記蛋白質(zhì)，可以實(shí)時(shí)追蹤蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位、運(yùn)動(dòng)和相互作用，深入了解蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能和參與的信號(hào)通路。

蛋白質(zhì)修飾研究：蛋白質(zhì)的修飾（如磷酸化、乙酰化、甲基化等）對(duì)其功能具有重要調(diào)節(jié)作用。Pro - Q Diamond 等專門(mén)用于檢測(cè)特定修飾蛋白質(zhì)的發(fā)光染液，為研究蛋白質(zhì)修飾提供了有力手段。通過(guò)檢測(cè)修飾蛋白質(zhì)的含量和分布變化，研究人員可以揭示蛋白質(zhì)修飾在細(xì)胞生理過(guò)程、疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

（二）生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)

重組蛋白生產(chǎn)與質(zhì)量控制：在重組蛋白藥物的生產(chǎn)過(guò)程中，需要對(duì)重組蛋白的表達(dá)、純化和質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格監(jiān)控。蛋白發(fā)光染液可用于檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)水平、純度以及是否存在降解產(chǎn)物。例如，在發(fā)酵液中提取重組蛋白后，使用 Lumitein™蛋白質(zhì)凝膠染色劑檢測(cè)蛋白質(zhì)含量和純度，確保產(chǎn)品質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，通過(guò)熒光染料標(biāo)記重組蛋白，可以研究其在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特性，為藥物研發(fā)提供重要數(shù)據(jù) 。

生物制品檢測(cè)：對(duì)于疫苗、抗體等生物制品，需要檢測(cè)其中蛋白質(zhì)的含量、活性和穩(wěn)定性。蛋白發(fā)光染液能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)生物制品中的蛋白質(zhì)成分，保障產(chǎn)品的安全性和有效性。例如，在流感疫苗生產(chǎn)過(guò)程中，利用 ECL 發(fā)光染液檢測(cè)疫苗中流感病毒蛋白的含量，確保疫苗劑量準(zhǔn)確。

（三）醫(yī)學(xué)診斷

疾病標(biāo)志物檢測(cè)：在臨床診斷中，檢測(cè)血液、尿液等體液中的疾病標(biāo)志物是早期診斷和病情監(jiān)測(cè)的重要手段。許多疾病標(biāo)志物為蛋白質(zhì)，通過(guò)蛋白發(fā)光染液結(jié)合免疫檢測(cè)技術(shù)，可以高靈敏度地檢測(cè)這些微量蛋白質(zhì)。例如，使用 ECL 超敏發(fā)光液檢測(cè)血液中的癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）等腫瘤標(biāo)志物，有助于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)后判斷；檢測(cè)血清中的心肌肌鈣蛋白等蛋白質(zhì)標(biāo)志物，可用于急性心肌梗死的快速診斷。

自身免疫性疾病診斷：自身免疫性疾病患者體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生針對(duì)自身蛋白質(zhì)的抗體。通過(guò)檢測(cè)這些自身抗體，結(jié)合蛋白發(fā)光染液進(jìn)行免疫印跡分析，可以輔助診斷自身免疫性疾病。例如，檢測(cè)抗核抗體、抗雙鏈 DNA 抗體等自身抗體時(shí)，使用熒光染料標(biāo)記的二抗，通過(guò)觀察熒光信號(hào)來(lái)判斷抗體的存在和滴度，為系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的診斷提供依據(jù) 。

蛋白發(fā)光染液作為蛋白質(zhì)檢測(cè)的關(guān)鍵技術(shù)工具，以其高靈敏度、高特異性和多樣化的應(yīng)用方式，在生命科學(xué)研究、生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)和醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的重要作用。隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新和發(fā)展，蛋白發(fā)光染液將不斷優(yōu)化和完善，為推動(dòng)生命科學(xué)研究的深入發(fā)展和人類(lèi)健康事業(yè)的進(jìn)步提供更強(qiáng)大的支持。