若后續(xù)需進(jìn)行 HE 染色、免疫組化，可采用 4% 多聚甲醛（PFA）室溫固定 15-30 分鐘（根據(jù)組織大小調(diào)整，如 1 cm3 組織固定 20 分鐘），固定后用 PBS 沖洗 3 次（每次 5 分鐘），去除殘留固定液，避免固定過(guò)度導(dǎo)致組織變硬、難切片；

若進(jìn)行酶活性檢測(cè)、脂質(zhì)染色，需避免固定，采用 “新鮮組織直接冷凍"，但需在 - 80℃液氮中快速速凍（＜5 分鐘），防止組織內(nèi)水分形成大冰晶（大冰晶會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致切片出現(xiàn)孔洞）。

對(duì)神經(jīng)組織、軟骨等易脆組織，可在包埋前用 10%-20% 蔗糖溶液（溶于 PBS）4℃浸泡 2-4 小時(shí)（組織沉底即可），蔗糖可滲透至細(xì)胞內(nèi)，降低組織冰點(diǎn)，減少冷凍過(guò)程中冰晶的形成，提升切片韌性。使用櫻花 SAKURA 高黏附型 OCT 包埋劑（貨號(hào) 4587）時(shí)，蔗糖處理后的組織黏附性可提升 20%，避免切片時(shí)組織與包埋劑分離。

常規(guī) HE 染色、組織形態(tài)觀察：選擇櫻花 SAKURA 常規(guī)型 OCT 包埋劑（貨號(hào) 4583），其低結(jié)晶配方可確保切片完整，性價(jià)比高；

免疫熒光、熒光原位雜交（FISH）：必須選擇低熒光型 OCT 包埋劑（貨號(hào) 4585），避免包埋劑自身熒光干擾目標(biāo)信號(hào)，實(shí)驗(yàn)前可通過(guò)熒光顯微鏡預(yù)檢測(cè)（激發(fā)波長(zhǎng) 488 nm 下，熒光強(qiáng)度應(yīng)＜50 RFU）；

脂肪、軟骨、骨骼等特殊組織：優(yōu)先使用高黏附型 OCT 包埋劑（貨號(hào) 4587），其 APTES 黏附促進(jìn)劑可增強(qiáng)組織與包埋劑的結(jié)合力，切片完整率提升至 85% 以上。

包埋前 1 小時(shí)將 OCT 包埋劑放入 4℃冰箱預(yù)冷（無(wú)需冷凍，避免結(jié)晶），預(yù)冷后的包埋劑黏度更穩(wěn)定，傾倒時(shí)不易產(chǎn)生氣泡；

向包埋模具（如櫻花 SAKURA 一次性包埋盒，貨號(hào) T200）中加入包埋劑時(shí)，需沿模具壁緩慢傾倒，若出現(xiàn)氣泡，可用移液器槍頭輕輕挑破，氣泡會(huì)導(dǎo)致切片出現(xiàn) “空白區(qū)"，影響觀察。

將處理好的組織放入包埋模具中央，確保組織四周均有 OCT 包埋劑包裹（包埋劑厚度≥2 mm），避免組織緊貼模具壁（模具壁冷凍速度快，易導(dǎo)致組織邊緣冷凍不均，切片時(shí)邊緣斷裂）。

對(duì)小組織（如直徑＜2 mm 的淋巴結(jié)），可先用少量包埋劑在模具底部鋪一層薄墊，再將組織放在墊上，防止組織下沉至模具底部，導(dǎo)致切片時(shí)無(wú)法完整獲取組織。

不建議將組織直接放入液氮中速凍（易導(dǎo)致組織表面瞬間結(jié)冰，內(nèi)部水分無(wú)法及時(shí)排出，形成大冰晶），推薦 “梯度速凍法"：先將包埋模具放入 - 20℃冷凍切片機(jī)冷凍室預(yù)冷 10 分鐘，待包埋劑表面凝固后，再轉(zhuǎn)移至 - 80℃冰箱冷凍 30 分鐘（或液氮上方 5 cm 處熏蒸 10 分鐘），使組織從外到內(nèi)緩慢冷凍，冰晶直徑可控制在 5 μm 以下，避免細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞。

柔軟組織（如腦組織、肝臟）：冷凍溫度控制在 - 18~-20℃，溫度過(guò)高易導(dǎo)致切片黏連在刀片上，溫度過(guò)低會(huì)使組織變脆，切片斷裂；

堅(jiān)硬組織（如皮膚、軟骨）：冷凍溫度需降至 - 22~-25℃，增強(qiáng)組織硬度，便于切片，但需避免溫度過(guò)低（＜-30℃），否則組織會(huì)出現(xiàn) “崩裂"；

脂肪組織：因脂肪導(dǎo)熱性差，冷凍溫度需穩(wěn)定在 - 20℃，且冷凍時(shí)間需延長(zhǎng)至 1 小時(shí)以上，確保脂肪凝固，否則切片時(shí)脂肪細(xì)胞易破裂，出現(xiàn)油滴。

切片過(guò)程中，冷凍切片機(jī)的溫度會(huì)因開(kāi)門取放樣品、刀片摩擦產(chǎn)熱出現(xiàn)波動(dòng)（±2℃），需每隔 30 分鐘觀察溫度顯示，若波動(dòng)超過(guò) ±1℃，需暫停切片，待溫度穩(wěn)定后再繼續(xù)。使用櫻花 SAKURA 低結(jié)晶 OCT 包埋劑時(shí)，即使溫度有輕微波動(dòng)，也能減少結(jié)晶產(chǎn)生，切片完整率保持在 90% 以上。

常規(guī)組織形態(tài)觀察（HE 染色）：切片厚度 5-8 μm，過(guò)薄易破碎，過(guò)厚會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞重疊，影響形態(tài)判讀；

免疫熒光實(shí)驗(yàn)：切片厚度 3-5 μm，薄切片可減少抗體滲透時(shí)間，降低非特異性染色，同時(shí)減少 OCT 包埋劑用量，降低熒光干擾；

連續(xù)切片（如腦組織冠狀面連續(xù)切片）：厚度控制在 5 μm，且需確保每片切片的厚度偏差＜0.5 μm（可通過(guò)冷凍切片機(jī)的厚度校準(zhǔn)功能實(shí)現(xiàn)），避免因厚度不均導(dǎo)致后續(xù)拼接困難。

切片速度控制在 2-5 mm/s（根據(jù)組織硬度調(diào)整），柔軟組織需慢切（2 mm/s），避免組織拉伸變形；堅(jiān)硬組織可稍快（5 mm/s），但需保持勻速，避免速度忽快忽慢導(dǎo)致切片出現(xiàn) “波紋"。

切片時(shí)刀片需與組織切面呈 15°-20° 角（非垂直切割），角度過(guò)小易導(dǎo)致切片擠壓，角度過(guò)大易切斷組織，可通過(guò)調(diào)整冷凍切片機(jī)的刀片支架角度實(shí)現(xiàn)最佳切割角度。

常規(guī)軟組織（肝臟、腎臟）：選擇櫻花 SAKURA 高碳鋼刀片（貨號(hào) S450），刀刃鋒利度高，可減少組織擠壓；

堅(jiān)硬組織（皮膚、骨骼）：使用碳化鎢刀片（貨號(hào) S600），耐磨性強(qiáng)，使用壽命是高碳鋼刀片的 3 倍，避免因刀片磨損導(dǎo)致切片出現(xiàn)刀痕；

免疫熒光實(shí)驗(yàn)：優(yōu)先選擇無(wú)熒光污染的刀片（如櫻花 SAKURA 低熒光刀片），避免刀片表面殘留的熒光物質(zhì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

每切完一個(gè)樣品后，需用無(wú)塵紙蘸取無(wú)水乙醇輕輕擦拭刀片表面（從刀刃向刀背方向擦拭，避免劃傷刀刃），去除殘留的 OCT 包埋劑與組織碎屑，防止交叉污染；

當(dāng)切片出現(xiàn)明顯刀痕、斷裂（排除組織與溫度問(wèn)題）時(shí)，需立即更換刀片，一般情況下，高碳鋼刀片每切 50-100 張切片需更換，碳化鎢刀片可切 300-500 張切片。

貼片前需將載玻片清洗干凈（用洗潔精浸泡 30 分鐘，超聲清洗 10 分鐘，蒸餾水沖洗 3 次，烘干），對(duì)易脫落的組織切片（如皮膚、脂肪），可使用多聚賴氨酸包被載玻片（櫻花 SAKURA 多聚賴氨酸載玻片，貨號(hào) M100），或在載玻片表面涂抹少量 10% 明膠溶液（晾干后使用），增強(qiáng)切片與載玻片的結(jié)合力，避免后續(xù)染色時(shí)切片脫落。

貼片時(shí)將載玻片放在 37℃恒溫臺(tái)上（溫度不宜過(guò)高，避免組織變性），用鑷子輕輕夾取切片，使其平整地鋪在載玻片中央，避免褶皺；

貼片后在 37℃恒溫臺(tái)放置 15-20 分鐘（或室溫放置 30 分鐘），讓切片自然干燥，干燥過(guò)快會(huì)導(dǎo)致切片收縮，干燥過(guò)慢易滋生細(xì)菌，影響染色。

干燥后的切片可直接放入 4% 多聚甲醛中固定 10 分鐘（或放入甲醇中固定 5 分鐘），固定過(guò)程中 OCT 包埋劑會(huì)被固定液溶解，無(wú)需單獨(dú)脫包埋劑；

固定后用蒸餾水沖洗 3 次（每次 3 分鐘），去除殘留的固定液與溶解的 OCT 包埋劑，避免背景染色。

因 OCT 包埋劑含聚合物，需先用 PBS 沖洗切片 5 分鐘（2 次），輕輕晃動(dòng)容器，使包埋劑逐漸溶解；若包埋劑殘留較多，可在 PBS 中加入 0.1% Triton X-100（增強(qiáng)滲透性），室溫孵育 10 分鐘，再用 PBS 沖洗干凈；

脫包埋劑后需立即進(jìn)行封閉（用 5% BSA 封閉 30 分鐘），避免組織抗原暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致降解，使用櫻花 SAKURA 低熒光 OCT 包埋劑時(shí)，脫包埋劑后的熒光背景可降低至 50 RFU 以下，無(wú)需額外處理。